Исследование изоферментов ЛДГ

  1. I. Энзикинетические методы.
  2. б.) Исследование концентрационной зависимости субстрата
  3. в.) Изучение субстратной специфичности
  4. II. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД
  5. Результат электрофореза

Столько, сколько вы выразились

Столько, сколько вы выразились.


загрузка

Определение сывороточных уровней активности фермента молочной дегидрогеназы в сочетании с измерением активности других ферментов (например, глутаминовой кислоты, оксалуксусной кислоты, трансаминазы, аланина пируваттрансаминазы, креатинкиназы и т. Д.) Является хорошо известным и широко используемым методом диагностики заболеваний, связанных с разрушением тканей или изменением проницаемости мембран. характеристика. В случае сердечного приступа, ЛДГ составляет ок. Он начинает подниматься через 12 часов и достигает максимальной активности через 48-72 часа. Затем он возвращается в нормальное состояние прибл. В течение 7-12 дней. Скорость увеличения активности ЛДГ пропорциональна степени повреждения миокарда и может достигать трехкратного базового уровня. Тем не менее, повышение уровня LDH в сыворотке может наблюдаться в других случаях (например, анемия, опухоли и заболевания печени), поэтому важно определить, какое повреждение ткани вызвано повышенным уровнем LDH в сыворотке. В этом помогает изучение профиля изофермента ЛДГ. Молекула тетрамера LDH может состоять из двух типов мономеров, которые кодируются отдельным геном, так что их аминокислотный состав различен. Две субъединицы обозначены как H (сердце = тип сердца) и M (мышца = тип мышц), и могут быть созданы пять типов изозимов ЛДГ.

  • LDH-1 = LDH (H4)

  • ЛДГ-2 = ЛДГ (Н3М)

  • LDH-3 = LDH (H2M2)

  • LDH-4 = LDH (HM3)

  • ЛДГ-5 = ЛДГ (М4)

В то время как изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-2 встречаются главным образом в миокарде и эритроцитах, печень и гладкие мышцы содержат изофермент ЛДГ-5. Хотя каждый изофермент катализирует реакцию молочной кислоты + NAD + пировиноградная кислота + NADH + H +, из-за различного аминокислотного состава изоферменты можно различить с помощью ферментативных кинетических методов и гель-электрофореза и последующего окрашивания активности.

I. Энзикинетические методы.

а.) испытание на термостойкость

Образец сыворотки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в присутствии NADH + H + при 57 ° C и 65 ° C. Активность фермента молочной кислоты дегидрогеназы определяют из охлажденных образцов. Образец комнатной температуры дает общую активность фермента. Разница в активности LDH образца, инкубированного при 57 ° C и поддерживаемого при комнатной температуре, дает активность LDL (которая представляет собой повышенное заболевание печени). Ферментативная активность, инкубированная при 65 ° С, дает термостойкий ЛДГ, значение которого увеличивается при инфаркте.

б.) Исследование концентрационной зависимости субстрата

Используется физиологически значимое различие, заключающееся в том, что, хотя изофермент ЛДГ-1 максимально активен при концентрации молочной кислоты 250 мМ, фермент ЛДГ1 имеет оптимальную концентрацию молочной кислоты 10 мМ, а молочная кислота 250 мМ является активностью изофермента ЛДГ1. 50% тормозит это. Таким образом, если активность фермента измеряется при концентрации 10 мМ и 250 мМ молочной кислоты, из соотношения измеренных активностей можно определить, содержит ли образец в основном ЛДГ-1 или ЛДГ-5.

в.) Изучение субстратной специфичности

Анализ основан на том факте, что разные изоферменты проявляют разное сродство к 0,33 мМ пирувата или. Использование 3,3 мМ 2-оксобутират (HB) субстратов. Изофермент LDH-1 более активен с оксобутиратом, в то время как изофермент LDH-5 проявляет гораздо более высокую активность фермента при использовании пирувата. Соотношение HBDH / LDH в нормальной сыворотке составляет от 0,63 до 0,81. Если уровень ферментативной активности сыворотки выше 0,81, можно сделать вывод о инфаркте, тогда как значения менее 0,63 указывают на заболевание печени. В этой практике мы будем использовать метод C. обычно используется в клинике. Спектрофотометрическое измерение основано на том факте, что пик поглощения при 340 нм в спектре поглощения молекулы NADH отсутствует в спектре молекулы NAD +. Таким образом, при запуске из оксо-субстрата и NADH в соответствии с уравнением 1 измеряют уменьшение абсорбции на 340 нм в зависимости от времени инкубации, которое пропорционально активности фермента. е 340 нм = 6,22 * 103 см2 / ммоль

решения:

  • 1.) 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5

  • 2.) Растворите 8 × 10-3 М НАДН в фосфатном буфере.

  • 3.) растворяют в 10-2М пирозовой кислоте в фосфатном буфере

  • 4.) растворяют в 10-1М α-кетобутиратфосфатном буфере

  • 5.) фермент ЛДГ-1

  • 6.) Фермент ЛДГ-5

Эксперимент: измерьте следующие компоненты (мл) в кюветах фотометра: Эксперимент: измерьте следующие компоненты (мл) в кюветах фотометра:

Используя образец 1 в качестве бланка, измерьте начальную активность LDH1 в кюветах 2 и 3, а затем в пирувате или цитокине. Через 15 секунд реакцию инициировали добавлением 2-оксобутирата в кюветы 2 и 3. Поглощение измеряли при 340 нм каждые полминуты. С использованием бланка кюветы 4 фотометрия образцов 5 и 6 выполняется аналогичным образом. Рассчитайте активность фермента из линейного участка кривой времени вымирания. активность фермента (ед / л) = (E * V * 1000) / (мин * 6,22 * v) где:

  • V - общий объем реакционной смеси [мл]

  • e NADH 340 нм: 6,22 [см2 × моль-1]

  • c толщина кюветы [см]

  • v объем тестируемой сыворотки [мл]

Рассчитайте отношения HBDH / LDH.

II. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Изоферменты ЛДГ могут быть хорошо разделены с помощью электрофореза. Фермент LDH-1 мигрирует быстрее всего к аноду, и LDH-5 практически не перемещается с места нанесения. Другие изоферменты мигрируют с большей скоростью в анод, в зависимости от молярного соотношения H-субъединицы. Электрофорез может проводиться как на агарозных, так и на целлюлозно-ацетатных и полиакриламидных носителях. Изоферменты можно визуализировать с помощью так называемых. метод окрашивания активности, поскольку ферментативная реакция приводит к образованию нерастворимого цветного продукта в геле, где находится рассматриваемый белок.

материалы

  • 1.) предварительно отлитый 6,5% полиакриламидный гель

  • 2.) Запуск буфера

  • 3.) Образцы ЛДГ в буфере для образцов

  • 4.) 1 М Трис, рН 7,4

  • 5.) 0,01 М НАД +

  • 6.) 1 мг / мл тетразолиевого синего

  • 7) 1,6 мг / мл метазульфата феназина,

  • 8.) 1 М Na-лактат

Выполнение эксперимента: промойте карман для геля для образца приготовленного геля буфером для бегунка, а затем укрепите полиакриламидный гель между стеклянными пластинами в ванне. Пипетируйте 20–40 мл образца из различных препаратов LDH в карманы, затем осторожно положите на образцы рабочий буфер. Заполните полозья, подключите провода (положительный полюс внизу) и добавьте напряжение (до 200 В или 50 мА) к устройству. Через полтора часа, в соответствии с инструкциями практикующего врача, разберите устройство, порвите стеклянные пластины и поместите гель в раствор проявителя (14,8 мл воды, 4 мл 1 М трис-буфера, 12 мл тетразолиевого синего, 4 мл феназина). метасульфат, 4 мл 1 М Na-лактата) и инкубировали при 45 ° С в течение 10 минут в темноте. Вымойте гель водой и высушите его между фильтровальной бумагой. Расположение изоферментов показано на депонированном формазане. В цветовой реакции NAD + является коферментом, лактат является субстратом, феназин метасульфат является носителем электронов, а тетразолиевый синий является конечным акцептором электронов.

Результат электрофореза

Результат электрофореза

Ответьте на следующие вопросы:

  • 1.) Сколько полос вы видите в разных узорах?

  • 2.) Есть ли разница в интенсивности цвета разных полос?

  • 3.) Чем можно объяснить периодическое расположение полос?

  • 4.) Чем объясняются разные миграционные свойства разных изоферментов?

  • 5.) Что является основой для деятельности живописи?

  • 6.) Что лежит в основе спектрофотометрической дифференциальной диагностики?


Сколько полос вы видите в разных узорах?
Есть ли разница в интенсивности цвета разных полос?
Чем можно объяснить периодическое расположение полос?
Чем объясняются разные миграционные свойства разных изоферментов?
Что является основой для деятельности живописи?
Что лежит в основе спектрофотометрической дифференциальной диагностики?

Номера

Номерной фонд гостиницы насчитывает 173 номера различных категорий.

Забронировать отель можно прямо сейчас: Бронирование онлайн