- Профили связывания по всему геному GadEWX Ранее несколько сайтов связывания GadEWX были охарактеризованы...
- Геномные роли GadEWX regulons
- Эволюционные аспекты GadEWX regulons
Профили связывания по всему геному GadEWX
Наша команда-партнер Artmisto
Ранее несколько сайтов связывания GadEWX были охарактеризованы в E.coli с помощью экспериментов по связыванию ДНК in vitro и анализа мутаций. 16 , 17 , 18 , 27 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , Однако непосредственное измерение связывания GadEWX in vivo не было достигнуто. Поэтому мы использовали недавно разработанный метод ChIP-exo высокого разрешения для определения профилей связывания этих трех TF по всему геному in vivo с разрешением около 1 п.н. в E.coli при кислотном стрессе (pH 5,5).
Используя алгоритм поиска пиков (программа MACE), 16, 6 и 41 воспроизводимые пики связывания были идентифицированы для GadE, GadW и GadX, соответственно, в условиях кислотного стресса ( Рис. 1а а также Дополнительные таблицы 1–3 ). Количество сайтов связывания GadEWX было намного ниже, чем у глобальных TF, что позволяет предположить, что GadEWX может действовать как локальные TF для снятия кислотного стресса. Всего было идентифицировано 16, 4 и 23 сайта связывания с несколькими пиками для GadE, GadW и GadX соответственно ( Рис. 1б ). Мы также обнаружили, что сайты связывания GadX in vivo включают все сайты связывания GadW, как было предложено в предыдущем сравнительном исследовании транскриптома. 17 , Такое количество сайтов связывания и их перекрытие позволяют предположить, что GadE и GadX играют более широкие роли, чем GadW, и что они имеют различные регуляторные сети друг от друга 32 , Перед этим исследованием 16 сайтов связывания были идентифицированы in vitro для GadEWX с убедительными экспериментальными данными, 50% (8 из 16) из которых были также обнаружены в этом исследовании ( Рис. 1с а также Дополнительная таблица 4 ). Неясно, почему эти восемь сайтов связывания отсутствуют в наборе данных, полученных здесь. Одна из возможностей заключается в том, что они могут быть обнаружены только методами in vitro и могут не возникать in vivo из-за вмешательства других регуляторов. В совокупности идентификация в общей сложности 35 новых сайтов связывания стала возможной благодаря новому методу ChIP-exo, развернутому здесь, что значительно расширило текущие знания о сфере действия регулирующей сети GadEWX.
Рисунок 1: Пейзаж всего генома сайтов, связывающих GadEWX.
( a ) Обзор GadEWX-связывающих профилей в геноме E.coli (KiloBase) в фазе среднего экспоненциального роста (OD 600 = 0,3) в условиях кислотного стресса (pH 5,5). Открытые и закрытые точки указывают на ранее известные и недавно найденные сайты связывания GadEWX, соответственно. S / N обозначает отношение сигнал / шум. (+) и (-) указывают чтения, отображенные на прямой и обратной нитях, соответственно. Пики связывания, которые перекрываются с сигналом Mock-IP, были устранены. Красный, GadE; Зеленый, GadW; Синий, GadX. ( б ) Перекрытия между GadEWX-связывающими сайтами в условиях низкого pH. ( c ) Сравнение сайтов связывания GadEWX, полученных из этого исследования (ChIP-exo), с известными из литературы сайтами связывания. ( d ) Логотипы последовательностей GadEWX-ДНК-связывающих мотивов.
Затем мы оценили ширину и местоположение генома сайтов связывания GadEWX, используя доступные в настоящее время аннотации генома. Ширина сайтов связывания каждого TF составляла 29 ± 3,6, 30 ± 7,6 и 28,7 ± 8,0 соответственно ( Дополнительный рис. 1 ). Большинство GadEWX-связывающих сайтов (88% или 38 из 43) были обнаружены в регуляторных областях (то есть, перед промоторами, промоторами и 5'-проксимальными по отношению к кодирующим областям). Оставшиеся 12% были обнаружены во внутригенных областях или между двумя кодирующими областями конвергентных генов ( Дополнительные таблицы 1–3 ). Эти результаты показывают сильное предпочтение местоположения GadEWX-связывающего сайта в некодирующих межгенных областях с относительно фиксированной шириной связывания. Чтобы идентифицировать мотивы последовательности ДНК этих вновь идентифицированных GadEWX-связывающих сайтов, мы использовали последовательность каждого пика связывания в процедуре поиска мотива. Идентифицированный мотив последовательности GadE из 16 пиков связывания (TTARGAWWWWAAATA) в основном соответствовал ранее охарактеризованному асимметричному сайту связывания GadE (TTAGGAttTTgTTATTTAAa) ( Рис. 1г ) 16 , Поиск мотива GadW и GadX по 6 и 41 пикам связывания, соответственно, также дал последовательность (AKGKCTGWTWTTWWYMYVAK), которая напоминала ранее сообщенный мотив связывания (AtGtcTGATtTttatattat) 17 , 31 , Этот же мотив обусловлен тем, что области связывания GadW перекрываются с областями GadX, как показано в предыдущем исследовании. 32 ,
Идентификация GadEWX regulons и причинных связей
В настоящее время в общей сложности 16 генов в 10 единицах транскрипции (TU) (GadE: 12 генов в 7 TU; GadW: 6 генов в 3 TU; и GadX: 10 генов в 6 TU) характеризовались убедительными доказательствами в качестве членов GadEWX. регулоны в кишечной палочке 15 , 16 , 17 , 26 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , Основываясь на наших наборах данных ChIP-exo, мы можем значительно расширить размер регулонов GadEWX, включив 45 генов-мишеней в 31 TU (GadE: 20 генов в 15 TU; GadW: 6 генов в 4 TU; GadX: 29 генов в 19 TUs, несколько генов совместно регулируются) ( Дополнительные таблицы 1–3 ). Функциональный анализ с кластерами категорий ортологичных групп (COG) был выполнен, чтобы найти любое функциональное обогащение генов регулонов GadEWX ( Дополнительный рис. 2 ). Было обнаружено, что категория COG для метаболизма и транспорта аминокислот (E) статистически чрезмерно представлена (гипергеометрический тест P- значение = 4 × 10-6) и включает gadA , gadBC , gltBD и ybaST , чьи реакции тесно связаны с метаболизмом глутамата. , Кроме того, широкий спектр функциональных категорий COG указывает на то, что GadEWX может играть сложные роли, помимо регуляции генов в AFI, для координации связанных клеточных процессов в E.coli K-12 MG1655, поскольку GadE выполняет множественные роли в других патогенных штаммах E. coli. 38 , 39 , 40 , Кроме того, мы проанализировали, какие другие TF, как известно, регулируют эти 45 генов, основываясь на убедительных доказательствах в RegulonDB. 41 и обнаружил, что 21 из них регулируется 22 другими ТФ ( Дополнительная таблица 5 ). Интересно, что основные гены в системе GDAR ( gadA и gadBC ) регулируются тремя дополнительными TF (H-NS, FliZ и AdiY) 42 , 43 , Этот результат представляет важность сложной регуляции этих генов в соответствии с изменениями окружающей среды. Остальные 24 гена не регулировались напрямую другими TF, что означает, что GadEWX регулирует эти гены исключительно в ответ на кислотный стресс.
Чтобы определить причинно-следственные связи между связыванием GadEWX и изменениями уровней РНК-транскриптов генов в регулонах GadEWX, мы сравнили уровни транскриптов между штаммом дикого типа и уровнем каждого делеционного мутанта (Δ gadE , Δ gadW и Δ gadX ), выращенного в условиях кислотного стресса. В целом, по меньшей мере, один мутант дифференциально экспрессировал 351 ген. Гены с изменениями экспрессии с log2 кратным изменением ≥0,5 и ошибочным уровнем обнаружения <0,01 были определены как дифференциально выраженные. Только 25 из 351 были дифференциально экспрессированы у всех мутантов ( Дополнительный Рис. 3 а также Дополнительные данные 1–3 ). Это неожиданно небольшое перекрытие в ответе на транскрипцию предполагает, что каждый TF имеет специфический ответ на транскрипцию и может играть определенную роль в регуляции системы AR.
Известно, что RpoS, один из альтернативных сигма-факторов в E.coli , имеет решающее значение для экспрессии GadEWX и GDAR, а также для общего управления стрессом в сочетании с EvgS / EvgA и PhoQ / PhoP. 44 , 45 , 46 , Чтобы исследовать участие RpoS в регуляции регулонов GadEWX, мы дополнительно выполнили ChIP-exo для определения профиля связывания in vivo RpoS в условиях кислотного стресса. Комбинируя наши карты связывания GadEWX и RpoS с GadEWX-зависимым транскриптомом, мы могли определить причинно-следственные связи между связыванием GadEWX и изменениями уровней транскриптов генов в регулонах GadEWX при кислотном стрессе, а также вовлечением RpoS для экспрессии ( Рис. 2 ). Из 45 генов-мишеней, идентифицированных по результатам анализа GIPEWX на ChIP-exo, мы определили, что 19 генов в 13 TU (GadE, 11 генов в 7 TU; GadX, 10 генов в 7 TU ; gadBC перекрываются) (43%) были напрямую отрегулированы GadEWX в условиях кислотного стресса ( Рис. 2а , Дополнительный Рис. 4 а также Дополнительные таблицы 1–3 ). Кроме того, экспрессия 62% членов GadEWX regulon (28 из 45) была вовлечена в ассоциацию RpoS ( Дополнительный Рис. 4 а также Дополнительные таблицы 1–3 ). Среди связывающих событий RpoS на членах GadEWX regulon 64% из них (18 из 28) были новыми ( Дополнительный Рис. 4 а также Дополнительные таблицы 1–3 ). Этот результат подтверждает важность рекрутирования RpoS для ответа на кислотный стресс и расширяет текущие знания об участии RpoS в E.coli .
Рисунок 2: Геномная идентификация регулонов GadEWX и участие RpoS.
( а ) Сравнение результатов ChIP-exo и профилей экспрессии генов для определения прямых регулонов GadEWX. Примеры ( б ) GadE-регулона ( hdeAB-yhiD и hdeD с расходящимися промоторами) и ( в ) GadX-регулона ( gadBC и ydeN ). S / N обозначает отношение сигнал / шум. (+) и (-) в данных ChIP-exo указывают чтения, отображенные на прямой и обратной нитях, соответственно.
Например, дивергентные промоторы вверх по течению от hdeA и hdeD TU были интенсивно заняты GadE и RpoS, и это связывание GadE значительно увеличивало уровень транскриптов нижестоящих генов в кислой среде ( Рис. 2б ). Кроме того, GadE выступил в качестве активатора на других промоутеров ( Дополнительная таблица 1 ). Расчет относительного расстояния от привязок GadE до стартового сайта транскрипции 41 , 47 показали, что сайты связывания GadE локализованы в дальнейших или ниже по течению промоторной области (-35 и -10 боксов) ( Дополнительная таблица 1 ). Это наблюдение предполагает, что GadE может предотвращать связывание других репрессоров или напрямую активировать транскрипцию с помощью другого механизма, такого как рекрутинг RNAP для активации транскрипции 32 , Однако, в отличие от GadE, GadX действовал как двойной регулятор либо для активации, либо для подавления транскрипции генов-мишеней. Например, ассоциация GadX и RpoS на промоторе gadB повышает уровень транскрипта при кислотном стрессе ( Рис. 2с ). Однако связывание GadX с промотором ydeN снижало уровень транскрипта, и ассоциация RpoS не наблюдалась ( Рис. 2d ). Хотя GadW связан с промоторными регионами ( Дополнительная таблица 2 ), мы не смогли наблюдать значительных изменений уровней транскриптов при нокауте gadW, как показано в предыдущем исследовании транскриптома 17 , Кроме того, оставшиеся 59% генов (включая гены-мишени GadW) не имели значительных изменений в уровнях транскриптов, несмотря на связывание соответствующих TF. Эти результаты указывают на то, что для изменения их уровней транскриптов могут потребоваться дополнительные регуляторные сигналы, такие как ассоциация или диссоциация других TF.
Геномные роли GadEWX regulons
Чтобы определить, как GadEWX когерентно регулирует экспрессию генов в ответ на кислотный стресс, мы реконструировали регуляторную сеть GadEWX по всему геному в E.coli . Сначала мы изучили регуляторную схему, которая входит в GadEWX. Хотя мы обнаружили привязки каждого TF на самом себе или на других TF, как известно ранее 2 мы не смогли наблюдать изменения уровней транскриптов по ассоциации этих TF, за исключением репрессии gadW с помощью GadX ( Рис. 3а ). Поскольку мы сравнили уровни транскриптов между диким типом и каждым из мутантов делеции (Δ gadE , Δ gadW или Δ gadX ), чтобы определить причинно-следственные связи, мы не можем исследовать ауторегуляцию TF. Предыдущее исследование показало, что транскрипция gadE активируется GadW и GadX, когда клетки выращивают до стационарной фазы при pH 5,5 в среде LB-глюкозы. 18 , Однако другая фаза роста или ростовая среда могли бы способствовать различной регуляции транскрипции gadE . ( Рис. 3а а также Дополнительные таблицы 2 и 3 ). Мы считаем, что несколько цепей повторного управления, состоящих из других регуляторов, по-прежнему активируют GadE, что крайне важно в системе GDAR для AR, даже если GadW или GadX удалены 48 ,
Рисунок 3: Роль регуляторов GadEWX в E.coli в масштабе всего генома.
Регуляция ( а ) регуляторных цепей GadEWX и ( б ) основных генов в системе глутамат-зависимой кислотостойкости (GDAR). Закрытые и открытые кружки показывают, связаны ли гены-мишени TF или нет. Треугольник, перевернутый треугольник и тире указывают, активируются, подавляются или не изменяются уровни экспрессии генов-мишеней при нокауте TF. Красный, GadE; Зеленый, GadW; Синий, GadX. ( c ) Принципиальная схема восстановленного регуляторного мотива GadEWX для кислотного гомеостаза pH. GadEWX подавлял протон-приток (TI) и протон-генерирующие метаболические ферменты (MG), в то время как активировал протон-потребляющие метаболические ферменты (MC). Мы не смогли наблюдать регуляцию протон-эффлюксной системы (TE) с помощью GadEWX. IM, внутренняя мембрана; ОМ, наружная мембрана. ( d ) Регуляторные сети GadEWX регулируют различные функции сотовой связи. Стрелки с пунктирными линиями указывают на то, что регуляция не наблюдается в этом исследовании.
Недавнее кинетическое исследование промоторов и регуляторов в системе AR2 показало, что GadX (двойная мутация gadXW ) не влияет на кинетику промоторов основных генов ( gadA и gadBC ) в системе GDAR. 48 , Однако другой сравнительный анализ транскриптома показал, что эти промоторы значительно активируются GadX. 17 , Интересно, что наше исследование показало, что и GadE, и GadX активируют транскрипцию этих основных генов, но с разным коэффициентом активации (более чем 50-кратная активация GadE, но менее чем в 2 раза GadX; Дополнительные данные 1 и 3 ). Эти результаты показывают, что GadE является гораздо более сильным активатором, чем GadX, и, следовательно, GadX не может полностью компенсировать потерю активации системы GDAR, вызванную удалением gadE . Аналогичным образом, физиологические исследования, показывающие, что мутант gadE был более чувствительным к кислотному заражению, чем мутант gadX, также подтверждают это наблюдение. 16 , 17 , 49 ,
Всесторонняя реконструкция регуляторной сети GadEWX в E.coli по всему геному позволила нам расширить сферу ее роли в условиях кислотного стресса. После функциональной классификации 43 генов из 45 регулонов GadEWX, исключая gadEW , мы обнаружили, что функции 23% (10) из этих генов были в основном вовлечены в потребление, генерацию и транспорт протонов. В условиях кислотного стресса только GadX-репрессированные гены, участвующие в генерации и притоке протонов, такие как speG (спермидин ацетилтрансфераза) и dtpA (протон-зависимый транспортер олигопептидов) ( Рис. 3с ). С другой стороны, и GadE, и GadX активировали несколько генов, таких как gadA и gadB, которые кодируют энзимы , потребляющие ферменты. Мы не могли наблюдать какие-либо протон-эффлюксные системы, регулируемые GadEWX в E.coli K-12 MG1655. Исходя из этого анализа, мы полагаем, что GadEWX соединяет протон-отток / приток и генерирующие / потребляющие ферменты с парами петель отрицательной обратной связи для поддержания внутриклеточной концентрации протонов для гомеостаза рН ( Рис. 3с ).
В дополнение к контролю протонного потока, GadE непосредственно регулировал экспрессию генов, кодирующих шаперон ( hdeA и hdeB ) 5 , И GadE, и GadX участвовали в контроле экспрессии других генов, связанных с резистентностью к кислоте ( asr , slp , yhiM , yhiD и hdeD ), которые, как известно, повышают выживаемость клеток в условиях кислотного стресса. 17 , 49 , 50 ( Рис. 3d а также Дополнительный Рис. 4 ). Основываясь на связывающих свойствах всего генома, GadX, вероятно, будет участвовать в регуляции общей реакции на стресс ( uspB , uspA и uspD ). Интересно, что GadEWX координировался с другими регулирующими сетями ( iraP , cnu , micF , nhaR , asnC и dctR ), что указывает на то, что GadEWX может играть более сложные роли в геноме в сочетании с другими TF. Несколько генов с предсказанными или неизвестными функциями ( yjbQ , yjbR , yjjU , yjtD , yiiS , ynfB , yfaL , yqeK , ygeF и ygeH ) также регулировались GadE и GadX ( Рис. 3d ). Недавние исследования показали, что экспрессия генов локуса вымывания энтероцитов (LEE) для патогенеза E. coli O157: H7 косвенно регулируется GadE и GadX 39 , 40 , В E.coli K-12 MG1655 мы обнаружили пики связывания GadX ( yqeK , ygeF и ygeH ) в пределах остатка острова патогенности ( Дополнительная таблица 3 ). Поскольку было обнаружено, что GadE и GadX косвенно регулируют LEE в E.coli O157: H7 (ref. 39 ), исследование связывания генов in vivo этих регуляторов у патогенных штаммов может выявить регуляторные каскады в LEE, которые вызывают патогенность. Для дальнейшего изучения физиологической роли членов GadEWX regulon с предсказанными или неизвестными функциями в условиях кислотного стресса мы выбрали пять генов ( yjbQ , yjbR , yjjU , yjtD и yiiS ), которые либо были активированы, либо не показали причинно-следственной связи при однократном нокауте TF. Анализ устойчивости к кислотному стрессу у нокаутных штаммов этих генов показал, что они не были напрямую связаны с GDAR, но три из них ( yjjU , yjtD и yiiS ) были вовлечены в общую AR ( Дополнительный Рис. 5 ). Этот результат указывает на то, что GadEWX вносит вклад в генерирование более глобальных кислотоустойчивых ответов в E.coli, выходящих за рамки регулирования системы GDAR.
Эволюционные аспекты GadEWX regulons
Недавний опрос по консервационному анализу системы gadBC в основном кишечных бактерий показал, что присутствие и экспрессия этого оперона у патогенных бактерий тесно связаны с требованием выживать в чрезвычайно кислых условиях, но необязательно у других непатогенных бактерий. 12 , Мы также расширили наше исследование того, как E.coli GadEWX и их целые регулоны эволюционировали в типе протеобактерий, включая 134 γ-протеобактерии, 40 β-протеобактерий и 58 α-протеобактерий. Сначала мы сравнили сохранение генов, кодирующих регуляторы ( gadEWX ). Они почти законсервированы в Escherichia и Shigella , но не в Salmonella , Yersinia и даже в более отдаленных энтеробактериях ( Рис. 4 ). Как указано в предыдущих исследованиях 12 , 51 Присутствие системы GDAR ( gadA , gadB и gadC ) у этих бактерий позволило бы им выжить в крайне кислой среде (pH 2) в присутствии глутамата. Интересно, что gadX, а также gadAB консервативны в некоторых β- и α-протеобактериях, тогда как gadE и gadW - нет. Возможно, только GadX сможет частично отрегулировать систему GDAR, когда GadE отсутствует в этих классах. Гены, связанные с потреблением / образованием протонов ( gltBD , gcvHTP , ybaS и т. Д.), Демонстрировали более высокий коэффициент сохранения среди протеобактерий даже у видов, которые не имеют системы GDAR ( Рис. 4 ). Эти гены могут регулироваться другими TF и участвовать в контроле внутриклеточного протонного потока.
Рисунок 4: Эволюция регулонов GadEWX.
Показатели сохранения GulEWX-регулонов по γ-, β-, α-протеобактериям представлены на основании расчета ортолога. Гены подразделяются по функциональным категориям.
Поддерживая гомеостаз pH в щелочной среде, антипортер Na + / H + играет решающую роль в адаптации к щелочной среде. 4 , Следует отметить, что nhaR, кодирующий активатор антипортера Na + / H +, прочно связывался с GadX и RpoS в условиях кислотного стресса ( Дополнительная таблица 3 ). Поскольку делеция GadX не оказала значительного влияния на уровень транскрипции nhaR , могут потребоваться дополнительные ассоциации сигнала и / или TF при регуляции этого активатора в кислой среде, чтобы он мог активироваться только в щелочной среде. В отличие от системы GDAR, кажется, что участие катион-протонного антипортера является широко используемой стратегией для щелочного заражения протеобактерий, учитывая высокую степень сохранения nhaR ( Рис. 4 ).
